CRISPR sgRNA文庫(kù)構(gòu)建與篩選應(yīng)用實(shí)例

Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells Ophir Shalem et al. Science 343, 84 (2014)

已知藥物功能篩選其耐藥靶點(diǎn)的方案：

1.明確該藥物功能及其致死工作濃度。

2.構(gòu)建 CRISPR-Cas9 gRNA慢病毒文庫(kù)并侵染細(xì)胞，構(gòu)建整合CRISPR-Cas9 gRNA的細(xì)胞混合克隆。

3.篩選：高濃度藥物短期內(nèi)持續(xù)作用細(xì)胞混合克隆，成活的細(xì)胞即為產(chǎn)生耐藥性的細(xì)胞，其耐藥性的產(chǎn)生原因是 CRISPR-Cas9 gRNA導(dǎo)致的基因改變。

4.存活的細(xì)胞通過(guò)二代測(cè)序，比對(duì)得到gRNA 信息，從而推斷出起作用的基因靶點(diǎn)。